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II. Background InformationMonsanto Canada Inc. has developed a cotton line, designated MON 88913, which has enhanced tolerance to glyphosate, the active ingredient in the herbicide Roundup®. The enhanced herbicide tolerant trait in cotton line MON 88913 will enable the over-the-top application of Roundup® agricultural herbicides at later stages of development than is possible with cotton lines MON 1445 and MON 1698 (lines 1445 and 1698 were approved in Canada for feed use in 1997). This is intended to provide greater flexibility and convenience in weed control options during crop production. Cotton line MON 88913 was developed using Agrobacterium mediated gene transfer technology, resulting in the introduction of two copies of the epsps (5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase) gene from Agrobacterium sp. strain CP4. The CP4 version of the EPSPS protein imparts reduced glyphosate sensitivity to the modified plant. The use of two different promoters to control the expression of the cp4 epsps genes confers the enhanced tolerance to glyphosate. The cp4 epsps coding region is fused to a chloroplast transit peptide sequence, which directs the translated protein to the chloroplast, the site of amino acid biosynthesis. Monsanto Canada Inc. has provided data on the identity of cotton line MON 88913, a description of the transformation method, data and information on the gene insertion site, gene copy number and levels of CP4 EPSPS in the plant and the role of the inserted genes and regulatory sequences. The CP4 EPSPS protein from MON 88913 was shown to be equivalent to the protein produced in an Escherichia coli expression system developed to produce the protein. The E. coli produced CP4 EPSPS was used to generate sufficient quantities of pure protein for safety studies. References to relevant scientific publications were included in the submission. Phenotypic data for cotton line MON 88913 were collected from fourteen field locations in the United States under confined research field trial conditions in 2002. Compositional and expression data were collected from four of these locations. Agronomic characteristics of cotton line MON 88913 such as plant morphology, disease susceptibility, agronomic performance and reproductive fitness were compared to those of unmodified cotton counterparts. Nutritional components of cotton line MON 88913 such as proximates, amino acids and fatty acids were compared with unmodified cotton counterparts. The Feed Section, CFIA, with input from the Plant Biosafety Office, CFIA, has reviewed the above information. The following assessment criteria as described in regulatory directives Dir95-03 and Dir94-08 were used to determine the safety and efficacy as livestock feed and the environmental safety of this novel feed:
III. Description of the Novel Traits1. Development Method Cotton line MON 88913 was created through the insertion of a fragment of DNA containing two copies of a gene derived from the Agrobacterium sp. strain CP4 (cp4 epsps), which imparts field level tolerance to glyphosate, the active ingredient in Roundup® herbicides. Cotton line Coker 312 was transformed with a plasmid vector carrying the synthetic cp4 epsps genes, both of which had been fused with a plant-derived coding sequence expressing an optimized chloroplast transit peptide. This peptide facilitates the import of the newly translated CP4 EPSPS enzyme into the chloroplast, the site of amino acid biosynthesis. The DNA sequence was introduced into Coker 312 by Agrobacterium mediated gene transfer. 2. Glyphosate Tolerance EPSPS is an enzyme involved in the shikimic acid metabolic pathway which is essential for the production of the aromatic amino acids. The native cotton EPSPS enzyme is sensitive to glyphosate. The herbicide disrupts the shikimic acid pathway, leading to growth suppression or death of the plant. The CP4 EPSPS version of this enzyme is expressed in cotton line MON 88913 and confers glyphosate tolerance since it continues to catalyze the production of aromatic amino acids in the presence of glyphosate due to a reduction in the binding of glyphosate to the CP4 EPSPS in comparison to the native EPSPS. The expression of the novel enzyme in the plant is driven by constitutively active promoters and was quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The CP4 EPSPS protein levels were assessed in young leaf, overseason leaf (OSL), root, seed and pollen tissues collected from field trials performed in 2002. ELISA assays demonstrated that the mean CP4 EPSPS protein levels across four sites for young leaf, OSL1, OSL2, OSL3, root and seed tissues were 970, 1400, 690, 630, 99 and 340 µg/g dry weight respectively. The mean CP4 EPSPS protein level in pollen across the four sites was 4.0 µg/g fresh weight. Unlike typical allergens, the CP4 EPSPS protein is present at low levels in cotton line MON 88913 (less than 0.12% of total protein in seed), is not glycosylated and was shown to be labile to digestion. Following incubation in simulated gastric fluid it was shown, through western blotting, that more than 95% of the CP4 EPSPS protein was digested within 15 seconds. Also, unlike known allergens, it was shown that EPSPS activity was reduced by more than 90% within 15 seconds incubation time in simulated gastric fluid. The amino acid sequence of the CP4 EPSPS protein was compared to several protein sequence databases and was shown to share no significant structural similarity with any known toxic, allergenic or pharmacologically relevant proteins. Further analysis also showed that the CP4 EPSPS protein lacks immunologically relevant sequences. An acute mouse study reported no deleterious side effects when animals were administered CP4 EPSPS protein by oral gavage at doses up to 475 mg/kg. Due to the low levels of CP4 EPSPS protein expressed in cotton line MON 88913 it was necessary to produce CP4 EPSPS by bacterial fermentation to obtain sufficient quantities to conduct some of the safety studies (acute oral mouse toxicity study, simulated gastric fluid digestion study). The bacterial produced protein was compared to the plant produced protein and shown to be of similar molecular weight, immunological reactivity and to have similar functional activity as the plant produced protein. Monsanto Canada Inc. has provided to the CFIA a method for detection and identification of MON 88913. 3. Stable Integration into the Plant's Genome Plants that were three generations removed from the original transformant were probed for the presence of the inserted DNA sequence on a Southern blot. Southern blot analysis of cotton line MON 88913 indicated that there is one site of integration of the introduced DNA and that the cp4 epsps gene expression cassettes are intact. Southern blot analysis also indicated that backbone plasmid sequences were absent in the genome of MON 88913. Polymerase chain reaction (PCR) was used to confirm the organization of the elements within the DNA insert. Southern blot analysis showed stability of the introduced DNA in the first five generations removed from the original transformant. Data presented also demonstrated that the genes segregated according to Mendelian inheritance in these generations. IV. Criteria for the Environmental Assessment1. Potential of Cotton line MON 88913 to Become a Weed of Agriculture or be Invasive of Natural Habitats Cotton (Gossypium hirsutum) is a perennial member of the Malvaceae (Mallow family), but it is cultivated as an annual crop. In the U.S. it is grown in an area which extends from Virginia southwards and west to California. It is not cultivated in Canada because it is not adapted to the environmental conditions found here as cotton requires a much longer hotter growing season to reach maturity than is found in any region of Canada. Additionally, neither plants nor seeds of Gossypium can survive freezing temperatures. The genus Gossypium shows no particular weedy aggressive tendencies. Cotton has been grown for centuries and has never been reported as a serious weed problem. The glyphosate-tolerant G. hirsutum lines 1445 and 1698 were authorized for feed use in 1997 and no indications of weediness or invasiveness of cotton in Canada have been reported since that authorization. The CP4 EPSPS protein in cotton line MON 88913 is identical to the CP4 EPSPS protein produced in lines 1445 and 1698. Line MON 88913 has been designed to have increased glyphosate tolerance relative to lines 1445 and 1698 due to changes in promoter sequences that lead to increased gene expression in reproductive tissues. There are no specific added genes for cold tolerance and CP4 EPSPS is not expected to contribute to winter survival ability nor change the inability of the cotton plant to complete its life cycle in the relatively short and cool growing season of Canada. Dormancy and germination characteristics of line MON 88913, the negative segregant control (which shares similar background genetics to MON 88913), and several reference varieties were measured in temperature-controlled growth chambers under seven different temperature regimes. All values for MON 88913 were either within the range of reference values or incrementally outside of the range provided. No significant differences were detected in percent viable hard seed (a potential measure of dormancy). Measurements on height, yield, and seed/boll characteristics of line MON 88913 and the control were recorded at harvest. When pooled across all locations, there were no significant differences between height, number of nodes, total number of bolls, number of vegetative bolls, number of abnormal bolls, total seed per boll, mature seed per boll, or immature seed per boll. A significant difference of 0.3 grams was recorded for seed index (grams per 100 fuzzy seed), but this difference likely has little biological impact on weediness. Line MON 88913 is therefore considered to be substantially equivalent to lines 1445 and 1698 with regards to invasiveness and potential to become a weed of agriculture. CFIA concludes that cotton line MON 88913 is unlikely to become a weed of agriculture or invasive of natural habitats. 2. Potential for Gene Flow to Wild Relatives and Potential for Hybrid Offspring to Become More Weedier or More Invasive Cotton pollen remains viable for about 12 hours but the grains are relatively large and heavy and not easily dispersed by wind. G. hirsutum is generally self-pollinating but can exhibit outcrossing in the presence of suitable insect pollinators (such as bumble bees (Bombus spp.) and honey bees (Apis mellifera)). Outcrossing frequency decreases with increasing distance from the pollen source. However, wild species of Gossypium are generally restricted to arid tropical or subtropical regions. There are no sexually compatible wild relatives of G. hirsutum native to Canada. Therefore, CFIA concludes that gene flow from glyphosate-tolerant cotton lines to wild Gossypium relatives is not possible in managed or unmanaged ecosystems in Canada. 3. Altered Plant Pest Potential Cotton is not a plant pest in Canada and the intended effect of the novel trait is unrelated to plant pest potential. The glyphosate-tolerant G. hirsutum lines 1445 and 1698 have been authorized for feed use since 1997 and have not demonstrated any altered pest potential in the Canadian environment during that time. Susceptibility of line MON 88913 to insect, disease, and abiotic stressors were evaluated in field experiments at 14 locations. Susceptibilities to aphids, beet armyworm, cotton bollworm, lygus, pink bollworm, stink bugs, tarnished plant bugs, thrips, tobacco budworm, whiteflies, boll rot, Pythium, Rhizoctonia, Verticillium, cold, drought, and heat were similar in line MON 88913 to the susceptibilities of the control plants to these stressors. No differences between line MON 88913 and the control were observed that would contribute to increased plant pest potential in Canada. The CFIA has therefore determined that Roundup Ready® Flex cotton line MON 88913 does not display any altered plant pest potential. 4. Potential Impact of Non-Target Organisms The CP4 EPSPS protein produced in line MON 88913 is identical to the CP4 EPSPS protein produced in lines 1445 and 1698. The source of this coding sequence is a common soil bacterium which is not a known human or animal pathogen and has not been previously reported as an allergen. The protein is rapidly digested in simulated gastric fluid (more than 95% of the protein was digested within 15 seconds) and there were no immunologically relevant homologous sequences to any known allergenic proteins, indicating a lack of allergenic potential. Additionally, no documented cases of allergy or adverse effects from the consumption of this protein in foods or feeds derived from other Roundup Ready® crops have been reported since their introduction in 1996. EPSPS proteins naturally occur in plant and microbially-based foods that have a history of safe consumption by humans and animals. CP4 EPSPS has been consumed directly or as processed products of Roundup Ready® crops since their commercialization in 1996 with no reported cases of toxicity. A compositional and nutritional assessment compared cottonseed, oil, and meal from line MON 88913 to cottonseed, oil, and meal from a negative control cotton line with similar background genetics. This assessment found no component values in cotton line MON 88913 that were outside of the range of those found in the unmodified counterparts. Cotton is well-known for naturally occurring toxicants and antinutrients (cyclopropanoid fatty acids and gossypol). Aflatoxins are toxic by-products of several varieties of fungi that can grow in cotton. Line MON 88913 was tested for four aflatoxins (B1, B2, G1, and G2) but, because 50% of all the samples taken were below the LOQ, further statistical analyses were not conducted. Cyclopropanoid fatty acids (malvalic acid, dihydrosterculic acid, and sterculic acid) levels in line MON 88913 were assessed and were found to be within the range of values observed in conventional cotton counterparts. Levels of gossypol were assessed and were also found to be within the range of values observed in conventional cotton counterparts. An acute oral toxicity study using E. coli-produced CP4 EPSPS protein was administered to mice. No adverse effects were observed at 475 mg of CP4 EPSPS protein/kg mouse body weight, and there were no differences in body weight, cumulative body weight, or food consumption between mice fed CP4 EPSPS protein and mice fed with a control protein (bovine serum albumin) at that level. The CFIA therefore concludes from the above data that the use of line MON 88913 will not have a greater impact on non-target organisms (including humans) than the use of lines 1445 or 1698 or the use of conventional cotton. 5. Potential Impact on Biodiversity No varieties of cotton, nor any wild relatives that can readily interbreed with cotton, can grow in the Canadian environment. Roundup Ready® Flex cotton line MON 88913 has no observed or expected modifications that would allow it to survive in the Canadian environment better than unmodified cotton. Roundup Ready® cotton lines 1445 and 1698 have been used as feed in Canada since 1997 and have not had any demonstrated impact on biodiversity. The CFIA therefore concludes that line MON 88913 will have no impact on biodiversity in Canada. V. Criteria for the Livestock Feed Assessment1. Potential Impact on Livestock Nutrition Nutritional Composition and Anti-Nutritional Factors The composition of cottonseed, cottonseed meal and cottonseed oil from line MON 88913 was compared with a negative-segregant control line. Acid-delinted whole cottonseed was analyzed in two trials and analysis included proximates, minerals, amino acids, fatty acids, cyclopropenoid fatty acids, gossypol, and vitamin E. Cottonseed meal and cottonseed oil were analysed in one of the trials. Cottonseed meal analysis included proximates, minerals, amino acids, cyclopropenoid fatty acids, and gossypol, while cottonseed oil analysis included fatty acids, cyclopropenoid fatty acids, gossypol, and vitamin E. Oleic acid, when expressed as a percentage of total fatty acids, was significantly altered but this difference was due to elevated values in the control line. Phenylalanine, when expressed as a percentage of total amino acids, was significantly higher in line MON 88913 than its control in both trials. However, both line MON 88913 and its control line fell within the range of the commercial reference varieties and the range of literature values for this analyte. There was no difference in phenylalanine when expressed as a percentage of total amino acids in cottonseed meal derived from whole cottonseed used in this trial. Several other analytes (tryptophan, linoleic acid and manganese) were found to be significantly different, but all of these values fell within the tolerance interval for the commercial reference varieties. Malvalic and sterculic acids, when expressed as a percentage of total fatty acids, were slightly, but significantly, different at one location in one of the trials. The means for these fatty acids fell within the range of the commercial reference varieties. The evidence provided by Monsanto Canada Inc. supports the conclusion that the nutritional composition of Roundup Ready® Flex cotton line MON 88913 is substantially equivalent to conventional cotton varieties. 2. Potential Impact on Livestock and Workers/By-standers EPSPS is an enzyme present in many foods with a long history of safe use in Canada, and therefore would not be expected to be toxic or allergenic. The CP4 EPSPS enzyme is from Agrobacterium strain CP4, a soil bacterium, which is not a known human or animal pathogen. The amino acid sequence of the CP4 EPSPS protein found in line MON 88913 is identical to the CP4 EPSPS protein in Roundup Ready® crops previously approved in Canada. CP4 EPSPS shares no biologically relevant significant homology with known toxins or allergens, it is present in small amounts in the feed, it is heat labile and it is rapidly degraded under the conditions present in the gastrointestinal tract. Additionally, a mouse acute oral toxicity study indicated no adverse effects at 475 mg/kg body weight CP4 EPSPS. Based on the information provided by Monsanto Canada, CP4 EPSPS is unlikely to be a novel toxin or allergen. Cotton is not known for the production of endogenous allergens and the transformation event which produced cotton line MON 88913 would not be expected to induce their synthesis. Based on the predicted exposure levels and the results of the above tests, no significant risk to livestock and workers/by-standers is expected from exposure to the CP4 EPSPS protein. VI. New Information RequirementsIf at any time, Monsanto Canada Inc. becomes aware of any information regarding risk to the environment, or risk to human or animal health that could result from release of these materials in Canada, or elsewhere, Monsanto Canada Inc. will immediately provide such information to the CFIA. On the basis of such new information, the CFIA will re-evaluate the potential impact of the proposed use and will re-evaluate its decision with respect to the livestock feed authorization of cotton line MON 88913. VII. Regulatory DecisionBased on the review of data and information submitted by Monsanto Canada Inc., including comparisons of cotton line MON 88913 with the unmodified parental counterparts, the Feed Section, CFIA, has concluded that the novel gene and its corresponding trait does not confer to the plants any characteristic that would raise any concerns regarding the safety or nutritional composition of cotton line MON 88913. Cottonseed and cottonseed meal and hulls are currently listed in Schedule IV of the Feeds Regulations and are, therefore approved for use in livestock feeds in Canada. Cotton line MON 88913 has been assessed and found to be as safe and as nutritious as traditional cotton varieties. Cotton line MON 88913 and its products are considered to meet the present ingredient definitions and are approved for use as livestock feed ingredients in Canada. Cotton line MON 88913 will not be grown in Canada nor can the seed overwinter, therefore the release of the feed into the environment would result in neither intended nor unintended environmental effects. Livestock feed use of cotton line MON 88913 is therefore authorized as of November 23, 2005. Cotton line MON 88913 and any other cotton lines derived from it may be imported and/or released, provided no inter-specific crosses are performed, provided the intended uses are similar, and provided it is known, based on characterization that these plants do not display any additional novel traits and are substantially equivalent to currently grown cotton, in terms of their specific use and safety for the environment and for human and animal health. Cotton line MON 88913 is subject to the same phytosanitary import requirements as its unmodified counterparts. Please refer to Health Canada's Decisions on Novel Foods for a description of the food safety assessment of cotton line MON 88913. The food safety decisions are available at the following Health Canada web site. This bulletin is published by the Canadian Food Inspection Agency. For further information, please contact the Feed Section at: Feed Section
Agence canadienne d'inspection
des aliments
Document de décision DD2005-56
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| Désignation(s) du nouvel aliment du bétail : | Lignée de cotonnier MON 88913, Identificateur de l’OCDE : MON-88913-8 |
| Demandeur : | Monsanto Canada Inc. |
| Espèce : | Cotonnier (Gossypium hirsutum L.) |
| Caractères nouveaux : | Tolérance à un herbicide (glyphosate) |
| Méthode d'introduction du caractère : | Transfert de gène au moyen d’Agrobacterium |
| Emploi proposé du nouvel aliment du bétail : | Production de coton pour l'obtention de fibres, de graines et de tourteaux servant à l'alimentation du bétail, ainsi que d'huile de coton pour la consommation humaine. Cette variété sera cultivée à l'extérieur du Canada, dans les régions productrices habituelles (c.-à-d. une région des É.-U. s'étendant vers le sud et l'ouest, depuis la Virginie jusqu'en Californie). Le Canada importera les graines et le tourteau de coton pour l'alimentation du bétail seulement. |
Monsanto Canada Inc. a mis au point une lignée de cotonnier, désignée MON 88913, qui possède une tolérance accrue envers le glyphosate, la matière active de l'herbicide Roundup®. Le caractère de tolérance accrue à l'herbicide chez la lignée de cotonnier MON 88913 permettra l'épandage d'herbicides agricoles Roundup® à des stades ultérieurs du développement de la plante, comparativement aux lignées de cotonnier MON 1445 et MON 1698 (les lignées 1445 et 1698 ont été approuvées pour l'alimentation du bétail au Canada en 1997). On aura ainsi plus de souplesse et de latitude dans le choix des options de lutte contre les mauvaises herbes dans le cadre de la production.
La lignée de cotonnier MON 88913 a été mise au point par la technologie de transfert de gène à l'aide d'Agrobacterium, technologie qui a résulté en l'introduction de deux copies du gène epsps (5-énolpyruvylshikimate-3-phosphate synthétase) de la souche CP4 d'Agrobacterium sp. La variante CP4 de la protéine EPSPS confère à la plante modifiée une sensibilité réduite au glyphosate. L'utilisation de deux promoteurs différents pour réguler l'expression des gènes cp4 epsps confère la tolérance accrue au glyphosate. La région codante des gènes cp4 epsps est fusionnée à une séquence codant un peptide de transport qui dirige la protéine traduite vers les chloroplastes, le site de la biosynthèse des acides aminés.
Monsanto Canada Inc. a fourni des données sur l'identité de la lignée de cotonnier MON 88913, une description de la méthode de transformation, des données et des renseignements sur le site d'insertion des gènes, le nombre de copies des gènes et la concentration de CP4 EPSPS dans la plante et le rôle des gènes insérés et des séquences de régulation. On a montré que la protéine CP4 EPSPS de la lignée MON 88913 est équivalente à la protéine produite dans le système d'expression de Escherichia coli destiné à produire la protéine. La protéine CP4 EPSPS produite par E. coli a été utilisée pour obtenir des quantités suffisantes de la protéine pure pour effectuer des études d'innocuité. Des références à des publications scientifiques pertinentes ont également été présentées.
Des données phénotypiques sur la lignée de cotonnier MON 88913 ont été obtenues dans le cadre d'essais au champ en conditions confinées à quatorze endroits aux États-Unis, en 2002. Des données sur la composition et l'expression ont été obtenues à quatre de ces endroits.
Certaines caractéristiques agronomiques de la lignée de cotonnier MON 88913, comme la morphologie, la sensibilité aux maladies, le comportement agronomique et l'adaptation du système de reproduction, ont été comparées à celles des contreparties de cotonnier non modifiées.
Les composantes nutritionnelles de la lignée de cotonnier MON 88913, comme les grands groupes de composants, les acides aminés et les acides gras, ont aussi été comparées à celles des lignées de cotonnier non modifiées.
La Section des aliments du bétail a passé en revue les renseignements qui précèdent, avec la participation du Bureau de la biosécurité végétale. Pour évaluer l'innocuité et l'efficacité des aliments du bétail dérivés des aliments nouveaux ainsi que le risque environnemental qui leur sont associés, on a utilisé les critères suivants, décrits dans les directives de réglementation Dir95-03 et Dir94-08 :
1. Méthode de mise au point
La lignée de cotonnier MON 88913 a été créée par insertion d'un fragment d'ADN contenant deux copies d'un gène dérivé de la souche CP4 d'Agrobacterium sp. (cp4 epsps), lequel confère aux plantes une tolérance au glyphosate, la matière active des herbicides Roundup®.
La lignée de cotonnier Coker 312 a été transformée au moyen d'un vecteur plasmidique portant les gènes synthétiques cp4 epsps, lesquels ont été fusionnés à une séquence codante d'origine végétale exprimant un peptide de transport vers les chloroplastes optimisé. Le peptide facilite l'importation de l'enzyme CP4 EPSPS nouvellement traduite dans les chloroplastes, le site de la biosynthèse des acides aminés. La séquence d'ADN a été introduite dans la lignée Coker 312 par transfert de gène au moyen d'Agrobacterium.
2. Tolérance au glyphosate
L'EPSPS est une enzyme qui joue un rôle dans la voie shikimique du métabolisme, laquelle est essentielle à la biosynthèse des acides aminés aromatiques. La variante de l'enzyme EPSPS que produit naturellement le cotonnier est sensible au glyphosate. Cet herbicide a pour effet de bloquer la voie shikimique, ce qui entraîne la mort de la plante ou une interruption de sa croissance. La lignée MON 88913 produit plutôt la variante CP4 EPSPS de l'enzyme, qui lui confère une tolérance au glyphosate, puisqu'elle continue de catalyser la synthèse des acides aminés aromatiques malgré la présence de glyphosate. En effet, cet herbicide se lie beaucoup moins au CP4 EPSPS qu'à l'EPSPS normalement produite par le cotonnier.
L'expression de la nouvelle enzyme dans la plante, sous le contrôle de promoteurs constitutifs, a été mesurée par dosage immunoenzymatique (ELISA). Les concentrations de la protéine CP4 EPSPS ont été mesurées dans des tissus de jeunes feuilles, de feuilles saisonnières (FS), de racines, de graines et de pollen prélevés dans le cadre d'essais au champ effectués en 2002. La concentration moyenne de protéine CP4 EPSPS mesurée par ELISA dans des tissus prélevés à quatre endroits était de 970, 1400, 690, 630, 99 et 340 µg/g de poids sec dans les jeunes feuilles, les FS1, les FS2, les FS3, les racines et les graines, respectivement. La moyenne de la concentration de protéine CP4 EPSPS dans le pollen s'établissait, aux quatre endroits, à 4,0 µg/g de tissus frais.
Contrairement aux allergènes habituels, la protéine CP4 EPSPS est présente en faibles concentrations dans la lignée de cotonnier MON 88913 (moins de 0,12 % des protéines totales dans la graine), elle n'est pas glycosylée et elle est labile à la digestion. Après incubation dans un milieu simulant les sucs gastriques, on a montré au moyen de la technique du transfert de Western que plus de 95 % de la protéine CP4 EPSPS est digérée en 15 secondes. En outre, contrairement aux allergènes connus, son activité est réduite de plus de 90 % après une incubation de 15 secondes dans un milieu simulant les sucs gastriques.
Après comparaison de la séquence d'acides aminés de la protéine CP4 EPSPS à celle de plusieurs protéines dans les bases de données, on a montré que cette protéine n'a aucune similitude structurale avec des protéines toxiques, allergènes ou à action pharmacologique connues. Une analyse plus poussée a montré que la protéine CP4 EPSPS est dépourvue de séquences à action immunologique. Une étude aiguë chez la souris n'a signalé aucun effet nocif chez l'animal à des concentrations de protéine CP4 EPSPS pouvant atteindre 475 mg/kg, par gavage oral.
Étant donné les faibles concentrations de protéine CP4 EPSPS exprimées dans la lignée de cotonnier MON 88913, il a fallu en produire par fermentation bactérienne pour en obtenir suffisamment de façon à effectuer certaines études d'innocuité (étude de toxicité aiguë par voie orale chez la souris, étude de digestion en milieu simulant les sucs gastriques). Une comparaison de la protéine produite par la bactérie et de la protéine produite par la plante a révélé qu'elles ont la même masse moléculaire, la même réactivité immunologique et la même activité fonctionnelle.
Monsanto Canada Inc. a fourni à l'ACIA une méthode de détection et d'identification de la lignée de cotonnier MON 88913.
3. Stabilité de l’intégration au génome de la plante
On a utilisé le transfert de Southern pour vérifier la présence de la séquence d'ADN introduite dans des plants de cotonnier éloignés du transformant original de trois générations. L'analyse par transfert de Southern de la lignée MON 88913 a indiqué qu'il y a un seul site d'intégration de l'ADN introduit et que les cassettes d'expression du gène cp4 epsps sont intactes. L'analyse par transfert de Southern a également indiqué qu'aucune séquence du plasmide lui-même n'est présente dans le génome de la lignée MON 88913. L'amplification par la polymérase (PCR) a permis de confirmer l'organisation des éléments dans la séquence d'ADN introduite. Une analyse par transfert de Southern a montré que l'ADN introduit dans le transformant original est stable durant cinq générations. Les données présentées démontrent également que les gènes sont transmis selon un mode de ségrégation mendélien au cours de ces générations.
1. Possibilité que la lignée de cotonnier MON88913 devienne une mauvaise herbe pour l’agriculture ou envahisse les habitats naturels
Le cotonnier (Gossypium hirsutum) appartient à la famille des Malvacées. Cette espèce est vivace mais se cultive comme une annuelle. Aux États-Unis, la zone de culture s'étend principalement, vers le sud et l'ouest, depuis la Virginie jusqu'en Californie. Le cotonnier n'est pas cultivé au Canada, car il ne peut s'adapter aux conditions écologiques qui caractérisent ces latitudes; en effet, aucune région du Canada ne peut fournir la saison de croissance longue et chaude que nécessite le cotonnier pour parvenir à maturité. En outre, ni les plants ni les graines de Gossypium ne peuvent survivre aux températures hivernales du Canada.
Le genre Gossypium n'a aucune tendance particulière à se comporter comme une mauvaise herbe. Le cotonnier, qui est cultivé depuis des siècles, n'a jamais été considéré comme une mauvaise herbe envahissante. Depuis l'autorisation des lignées de G. Hirsutum 1445 et 1698 tolérant le glyphosate comme aliment du bétail en 1997, on n'a obtenu aucun indice que le cotonnier pouvait se comporter comme mauvaise herbe ou devenir envahissant au Canada.
La protéine CP4 EPSPS présente dans la lignée de cotonnier MON 88913 est identique à celle qui est présente dans les lignées 1445 et 1698. La lignée MON 88913 a été conçue pour tolérer davantage le glyphosate que les lignées 1445 et 1698, par suite des modifications apportées aux séquences du promoteur qui entraînent une expression accrue du gène dans les tissus du système reproducteur. Aucun gène de tolérance au froid n'a été ajouté, et la protéine CP4 EPSPS ne devrait pas augmenter la capacité de survie du cotonnier en hiver ni le rendre plus apte à compléter son cycle de vie au cours de la saison de croissance relativement courte et froide qui caractérise le Canada.
Les caractéristiques de dormance et de germination de la lignée MON 88913, du témoin non ségrégant (qui possède un bagage génétique similaire à celui de la lignée MON 88913), et de plusieurs variétés de référence ont été mesurées dans des chambres de croissance à température contrôlée sous sept régimes de température différents. Toutes les valeurs obtenues pour la lignée MON 88913 se situaient dans la fourchette des valeurs de référence ou étaient supérieures aux valeurs comprises dans cette fourchette. Aucune différence significative n'a été décelée dans le pourcentage de graines dures viables (mesure potentielle de la dormance).
On a mesuré la hauteur, le rendement et les caractéristiques des graines et des capsules de la lignée MON 88913 et du témoin à la récolte. Après regroupement des valeurs mesurées à tous les endroits, on n'a observé aucune différence significative en ce qui concerne la hauteur, le nombre de noeuds, le nombre total de capsules, le nombre de capsules végétatives, le nombre de capsules anormales, le nombre total de graines par capsule, le nombre de graines matures par capsule ou le nombre de graines immatures par capsule. Une différence significative de 0,3 gramme a été mesurée pour le poids en grammes de 100 graines duveteuses, mais cette différence a probablement peu d'impact biologique sur l'aptitude de la plante à se comporter comme mauvaise herbe.
La lignée MON 88913 est donc considérée comme essentiellement équivalente aux lignées 1445 et 1698 en ce qui concerne la capacité d'envahissement et l'aptitude à devenir une mauvaise herbe en agriculture. L'ACIA conclut que la lignée de cotonnier MON 88913 est peu susceptible de devenir une mauvaise herbe en agriculture ou d'envahir les milieux naturels.
2. Possibilités de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage comme des mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement
Le pollen du cotonnier demeure viable pendant environ 12 heures, mais les graines sont relativement grosses et lourdes de sorte qu'elles ne sont pas facilement dispersées par le vent. G. hirsutum est généralement une espèce autofécondée, mais elle peut présenter une pollinisation croisée en présence d'insectes pollinisateurs appropriés tels que le bourdon (Bombus spp.) et l'abeille domestique (Apis mellifera). La fréquence de pollinisation croisée diminue avec la distance de la source de pollen.
Toutefois, les espèces sauvages de Gossypium ne se retrouvent généralement que dans les régions tropicales ou subtropicales arides. Il n'y a aucune espèce indigène sexuellement compatible apparentée à G. hirsutum au Canada. L'ACIA conclut donc que le flux génétique des lignées de cotonnier tolérant le glyphosate vers des espèces sauvages apparentées à Gossypium n'est pas possible dans les écosystèmes naturels ou aménagés au Canada.
3. Possibilité que la lignée de cotonnier MON 88913 devienne nuisible
Le cotonnier n'est pas une plante nuisible au Canada et l'effet recherché par l'introduction du caractère nouveau n'a aucun lien avec la capacité de ce végétal de devenir une mauvaise herbe. Les lignées de G. hirsutum 1445 et 1698 tolérant le glyphosate, autorisées comme aliment du bétail depuis 1997, n'ont montré depuis aucune capacité de devenir nuisibles dans l'environnement canadien.
La sensibilité de la lignée MON 88913 aux insectes, aux maladies et aux agents de stress abiotiques a été évaluée dans le cadre d'expériences au champ à 14 endroits. La sensibilité aux pucerons, à la légionnaire de la betterave, au ver de la capsule du cotonnier, au lygus, au ver rose de la capsule du cotonnier, aux pentatomes, à la punaise terne, au thrips, à la noctuelle verdoyante, à la mouche blanche, à la pourriture des capsules, au Pythium, au Rhizoctonia, au Verticillium, au froid, à la sécheresse et à la chaleur était la même chez les plants de la lignée MON 88913 et ceux de la lignée témoin. Aucune différence observée entre la lignée MON 88913 et la lignée témoin ne pourrait faire en sorte que la lignée MON 88913 devienne davantage nuisible au Canada.
L'ACIA a donc déterminé que la lignée de cotonnier Roundup Ready® MON 88913 n'est pas susceptible de devenir davantage nuisible.
4. Impact possible sur des espèces non visés
La protéine CP4 EPSPS produite par la lignée MON 88913 est identique à celle produite par les lignées 1445 et 1698. La source de la séquence codante est une bactérie terricole courante qui n'est pas réputée pathogène pour les humains ni les animaux et qui n'a jamais été tenue responsable d'effets allergènes. La protéine est rapidement digérée dans un milieu simulant les sucs gastriques (plus de 95 % de la protéine est digérée en moins de 15 secondes) et ne partage aucune séquence homologue de nature immunologique avec des protéines allergènes connues, ce qui indique que son pouvoir allergène est nul. En outre, aucun cas documenté d'allergie ou d'effet nocif provenant de la consommation de cette protéine dans des aliments destinés aux humains ou aux animaux dérivés d'autres cultures Roundup Ready® n'a été signalé depuis leur introduction en 1996.
Des protéines EPSPS se retrouvent naturellement dans des aliments d'origine végétale ou microbienne qui sont consommés sans danger depuis longtemps par les humains et les animaux. Aucun cas de toxicité n'a été signalé pour les protéines CP4 EPSPS qui sont consommées directement ou dans des aliments produits à partir de cultures Roundup Ready® disponibles depuis leur commercialisation en 1996. Une étude de la composition et de la valeur nutritionnelle de la graine, de l'huile et du tourteau a été effectuée pour comparer la lignée MON 88913 à une lignée de cotonnier témoin non modifiée au bagage génétique similaire. Aucune valeur pour aucun constituant de la lignée de cotonnier MON 88913 n'était hors de la fourchette des valeurs mesurées chez la contrepartie non modifiée.
On sait que le cotonnier renferme naturellement des substances toxiques et antinutritionnelles (acides gras cyclopropénoïdes et gossypol). Les aflatoxines sont des sous-produits toxiques de plusieurs variétés de champignons qui peuvent croître sur le cotonnier. Quatre aflatoxines (B1, B2, G1 et G2) ont été mesurées chez la lignée MON 88913, mais comme 50 % des échantillons prélevés se situaient sous la limite de quantification, aucune analyse statistique n'a été réalisée. Les concentrations d'acides gras cyclopropénoïdes (acides malvalique, dihydrosterculique et sterculique) dans la lignée MON 88913 se situaient dans la fourchette des valeurs observées chez les contreparties de cotonnier non modifiées. Les concentrations de gossypol étaient également dans la fourchette des valeurs observées chez les contreparties de cotonnier non modifiées.
Une étude de toxicité orale aiguë de la protéine CP4 EPSPS produite chez E. coli a été effectuée chez la souris. Aucun effet nocif n'a été observé à 475 mg de protéine CP4 EPSPS/kg de poids corporel, et aucune différence n'a été observée au niveau du poids corporel, du poids corporel cumulatif ou de la consommation des aliments chez les souris qui ont reçu la protéine CP4 EPSPS et celles qui ont reçu une protéine témoin (séroalbumine bovine) à cette concentration.
À la lumière des données ci-dessus, l'ACIA conclut donc que l'utilisation de la lignée MON 88913 n'aura pas plus d'impact sur les organismes non visés (y compris l'humain) que l'utilisation des lignées 1445 ou 1698 ou du cotonnier non modifié.
5. Impact possible sur la biodiversité
Aucune variété de cotonnier, ni aucune espèce sauvage apparentée pouvant se croiser facilement avec le cotonnier, ne peut croître dans l'environnement au Canada. La lignée de cotonnier Roundup Ready® MON 88913 ne comporte aucune modification observée ou prévue qui serait de nature à lui permettre de mieux survivre à l'environnement canadien que le cotonnier non modifié. Les lignées de cotonnier Roundup Ready® 1445 et 1690, qui sont utilisées comme aliments du bétail au Canada depuis 1997, n'ont eu aucun impact sur la biodiversité au Canada. L'ACIA conclut donc que la lignée de cotonnier MON 88913 n'aura aucun impact sur la biodiversité au Canada.
1. Effets possibles sur la nutrition du bétail
Composition nutritionnelle et facteurs antinutritionnels
La composition de la graine, du tourteau et de l'huile de la lignée MON 88913 a été comparée à celle de lignées témoins non ségrégantes. Dans le cadre de deux essais, on a mesuré dans la graine entière de cotonnier délintée par voie acide les grands groupes de composants, les minéraux, les acides aminés, les acides gras, les acides gras cyclopropénoïdes, le gossypol et la vitamine E. Le tourteau et l'huile ont été analysés dans le cadre d'un de ces essais. Dans le cas du tourteau, on a analysé les grands groupes de composants, les minéraux, les acides aminés, les acides gras cyclopropénoïdes et le gossypol, alors que dans l'huile, on a mesuré les acides gras, les acides gras cyclopropénoïdes, le gossypol et la vitamine E. La teneur en acide oléique, exprimée en pourcentage des acides gras totaux, était significativement différente, mais cette différence était due à des valeurs élevées chez la lignée témoin. La teneur en phénylalanine, exprimée en pourcentage des acides aminés totaux, était significativement plus élevée chez la lignée MON 88913 que chez la lignée témoin, et ce dans les deux essais. Toutefois, les valeurs mesurées pour cette substance chez la lignée MON 88913 et la lignée témoin se situaient dans la fourchette des valeurs observées chez les variétés commerciales de référence de même que dans la fourchette des valeurs publiées. On n'a pas observé de différence dans la teneur en phénylalanine exprimée en pourcentage des acides aminés totaux dans le tourteau dérivé des graines de cotonnier entières utilisées dans cet essai. Les concentrations de plusieurs autres substances (tryptophane, acide linoléique et manganèse) étaient significativement différentes, mais toutes les valeurs étaient comprises dans l'intervalle de tolérance fixé pour les variétés commerciales de référence.
Les concentrations des acides malvalique et sterculique, exprimées en pourcentage des acides gras totaux, étaient légèrement, mais significativement différentes à un endroit dans l'un des essais. La moyenne de ces acides gras était comprise dans la fourchette des valeurs publiées pour les variétés commerciales de référence.
Les données fournies par Monsanto Canada Inc. appuient la conclusion que la composition nutritionnelle de la lignée de cotonnier Roundup Ready® MON 88913 est essentiellement équivalente à celle des variétés de cotonnier non modifiées.
2. Impact possibles sur le bétail lui-même et les travailleurs ou des tiers
L'EPSPS est une enzyme présente dans de nombreux aliments qui sont utilisés sans risque depuis fort longtemps au Canada. Par conséquent, on ne s'attendrait pas à ce qu'elle soit toxique ni allergène. L'enzyme CP4 EPSPS est issue de la souche CP4 d'Agrobacterium, une bactérie terricole qui n'est pas un agent pathogène connu des humains ni des animaux. La séquence d'acides aminés de la protéine CP4 EPSPS que l'on trouve dans la lignée MON 88913 est identique à celle de la protéine CP4 EPSPS des cultures Roundup Ready® déjà approuvées au Canada. Le CP4 EPSPS n'a aucune homologie d'importance biologique avec des toxines ou allergènes connus, elle est présente en petites quantités dans l'aliment du bétail, elle est thermolabile et se dégrade rapidement dans le tractus gastrointestinal. De plus, une étude de toxicité orale aiguë sur des souris a montré que la protéine CP4 EPSPS n'a pas d'effet nocif à une concentration de 475 mg/kg de poids corporel. À la lumière des renseignements fournis par Monsanto Canada, on peut conclure qu'il est peu probable que le CP4 EPSPS soit une nouvelle toxine ou un nouvel allergène.
Le cotonnier n'est pas réputé produire des allergènes endogènes, et l'événement de transformation à l'origine de la lignée de cotonnier MON 88913 n'est pas susceptible de produire une telle synthèse.
Selon les niveaux d'exposition prévus et les résultats des épreuves susmentionnées, l'exposition à la protéine CP4 EPSPS ne devrait pas présenter de risque significatif pour le bétail, les travailleurs ou des tiers.
Si jamais la société Monsanto Canada Inc. prenait connaissance d'un risque pour l'environnement, y compris un risque pour la santé des humains et des animaux pouvant résulter de la dissémination de ces végétaux au Canada ou ailleurs, elle devrait immédiatement transmettre ces renseignements à l'ACIA. À la lumière de ces renseignements nouveaux, l'ACIA réévaluera l'impact potentiel de l'utilisation proposée comme aliment du bétail de la lignée de cotonnier MON 88913 et réexaminera les décisions qu'elle avait prises à cet égard.
Après examen des données et des renseignements présentés par Monsanto Canada Inc., y compris des comparaisons de la lignée de cotonnier MON 88913 avec des contreparties parentales non modifiées, la Section des aliments du bétail de l'ACIA conclut que le nouveau gène et son caractère nouveau correspondant ne confèrent pas à ces plantes des propriétés qui pourraient soulever des craintes quant à l'innocuité ou à la composition nutritionnelle de la lignée de cotonnier MON 88913. La graine, le tourteau et l'écorce de coton figurent actuellement à l'Annexe IV du Règlement sur les aliments du bétail. Leur utilisation est donc approuvée pour l'alimentation du bétail au Canada. La lignée de cotonnier MON 88913 s'est révélée, après évaluation, essentiellement équivalente aux variétés classiques de cotonnier sur le plan de l'innocuité et de la valeur nutritionnelle. La lignée de cotonnier MON 88913 et ses produits sont donc considérés comme conformes à la définition actuelle d'ingrédient, et leur utilisation en cette qualité dans les aliments du bétail est approuvée au Canada. En outre, comme cette lignée de cotonnier ne sera pas cultivée au Canada et que ses graines ne peuvent résister à l'hiver, la dissémination des aliments du bétail dans l'environnement n'aurait aucun effet, intentionnel ou non, sur l'environnement.
L'utilisation comme aliment du bétail de la lignée de cotonnier MON 88913 est par conséquent autorisée à compter du 23 novembre 2005. L'importation et/ou la dissémination de la lignée de cotonnier MON 88913 et de toute lignée qui en serait issue sont également autorisées, pourvu qu'aucun croisement interspécifique ne soit effectué, que leur utilisation prévue soit similaire et qu'une caractérisation approfondie ait démontré que ces végétaux ne présentent aucun autre caractère nouveau et qu'ils sont essentiellement équivalents aux variétés de cotonnier actuellement commercialisées quant à leur utilisation spécifique et à leur innocuité pour l'environnement et la santé humain et animale.
La lignée de cotonnier MON 88913 est assujettie aux mêmes conditions phytosanitaires d'importation que ses contreparties non modifiées.
On peut consulter les Décisions relatives aux aliments nouveaux de Santé Canada pour une description de l'évaluation de l'innocuité alimentaire de la lignée de cotonnier MON 88913. Les Décisions relatives aux aliments nouveaux sont accessibles sur le site Web de Santé Canada.
Ce bulletin est publié par l'Agence canadienne d'inspection des aliments. Pour de plus amples renseignements, communiquer avec la Section des aliments du bétail à l'adresse suivante :
Section des aliments du
bétail
Division de la santé des animaux
et de l'élevage
Direction des produits animaux
59, promenade Camelot
Nepean (Ontario) K1A 0Y9
Téléphone : (613) 225-2342
Télécopieur : (613) 228-6614
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